Luke Macfarlane, 19 Ocak 1980 tarihinde Kanada'nın Pembroke şehrinde doğmuştur. Gerçek adı Thomas Luke Macfarlane olan oyuncu, genç yaşlardan itibaren sahne sanatlarına ilgi duymuş ve bu alanda eğitim almıştır. 2003 yılında Juilliard Okulu'ndan mezun olduktan sonra, tiyatro sahnelerinde kendini göstermeye başlamıştır. Özellikle Broadway prodüksiyonlarında yer alarak dikkat çekmiştir.

Macfarlane, kariyerine televizyon dizileriyle devam etmiştir. 2004-2005 yılları arasında "Brothers & Sisters" adlı dizide Scotty Wandell karakteriyle büyük bir çıkış yakalamıştır. Bu rolü, onun hem oyunculuk yeteneğini hem de LGBT temalı karakterleri canlandırma konusundaki cesaretini sergilemiştir. Ayrıca, "Killjoys" adlı bilim kurgu dizisinde de önemli bir rol üstlenmiştir. Bu dizi, 2015-2019 yılları arasında yayınlanmış ve Macfarlane'in kariyerinde önemli bir yer edinmiştir.

Luke Macfarlane, sinema dünyasında da çeşitli projelerde yer almıştır. "The Memory Book" ve "The Mistletoe Promise" gibi Hallmark filmlerinde başrol oynamış, bu türdeki yapımlarla geniş bir izleyici kitlesine ulaşmıştır. Ayrıca, "The Brothers" ve "The Last Rites of Ransom Pride" gibi filmlerde de rol almıştır. Macfarlane, hem dram hem de romantik komedi türlerinde başarılı performanslar sergileyerek farklı karakterleri canlandırma yeteneğini göstermiştir.

Kariyeri boyunca çeşitli ödüllerle de onurlandırılmıştır. 2005 yılında GLAAD Media Ödülleri'nde "Brothers & Sisters" dizisindeki performansıyla dikkat çekmiş, bu ödül onun LGBT temalı projelerdeki katkısını takdir eden bir ödül olmuştur. Ayrıca, oyunculuğuyla birçok eleştirmen ve izleyici tarafından beğenilmiştir. Luke Macfarlane, hem sahne hem de ekran performanslarıyla kendine sağlam bir yer edinmiş, günümüzde de kariyerine devam etmektedir.